اثرات ژنوتوکسیک ویرایش هسته و هسته

nابزارهای جدید ویرایش ژن می توانند بازی ژن درمانی را تغییر دهند، اما دانشمندان باید رویکردهای جدیدی ایجاد کنند که جهش های ناخواسته را محدود کند. تکرارهای پالیندرومیک کوتاه خوشه ای با فاصله منظم سیستم (CRISPR)-Cas9 یکی از این ابزارهای ویرایش مستعد خطا است که بعدها دانشمندان آن را اصلاح کردند تا بار جهش آن را محدود کنند.¹ با این حال، مشخص نیست که تکنیک های اقتباس شده چه نامیده می شوند ویرایش اولیه و اولیهبا سیستم اصلی CRISPR-Cas9 مقایسه می شوند.² گزارش مجله بیوتکنولوژی های طبیعیمحققان موسسه علمی سان رافائل این را فاش کردند ویرایش اولیه و اولیه جهش های بیشتری از آنچه قبلا تصور می شد تولید می کند، اما آنها را کمتر از CRISPR-Cas9 ایجاد می کند.³

ویرایش ژن CRISPR-Cas9 متکی بر یک RNA راهنما است که به یک توالی DNA مورد نظر متصل می شود و یک آنزیم Cas9 که هر دو رشته DNA را در آن مکان قطع می کند و یک گسست دو رشته ای ایجاد می کند. دانشمندان قبل از استفاده از روش های مختلف برای هدایت تعمیر، توالی ها را در انتهای برش ویرایش می کنند. با این حال، اغلب توالی‌های DNA با انتهای بی‌نقص اضافی در هسته وجود دارد که می‌تواند به طور تصادفی با انتهای بریده شده در طول تعمیر اشتباه گرفته شود و منجر به جهش شود. بنابراین، محققان تکنیک‌های CRISPR-Cas9 را برای بریدن پایه از یک رشته و در عین حال دست‌نخورده ماندن رشته مکمل، اقتباس کردند، در نتیجه از اتصال تصادفی انتهای بریده‌شده و کند که منجر به جهش می‌شود، جلوگیری کردند.²

لوئیجی نالدینیمحقق ژن درمانی و یکی از نویسندگان این مطالعه، راه اندازی کرده است تجزیه و تحلیل هزینه فایده بر ابزارهای ویرایش ژن در طول زندگی حرفه ای خود^4.5 او گفت: برای ما واضح بود که ما [should] به طور مشابه، بررسی کنید که آیا ویرایش اولیه واقعاً مزیتی نسبت به فناوری ویرایش قبلی دارد یا خیر. او این فرضیه را مطرح کرد که زمانی که رشته‌ی شکاف‌دار از رشته مکمل دست‌نخورده در طول همانندسازی باز می‌شود، می‌تواند به‌عنوان الگویی برای ایجاد یک رشته دوم با شکاف عمل کند. این باعث ایجاد یک مارپیچ دوگانه DNA با انتهایی می‌شود که می‌تواند خودسرانه به انتهای صاف دیگری بپیوندد و در نتیجه DNA را در برابر جهش‌ها آسیب‌پذیر کند.

همچنین ببینید “جایگزین CRISPR برای اصلاح جهش هایی که سلول ها را نسبت به آسیب DNA حساس می کند“

برای اینکه بفهمند آیا ویرایشگرهای پایه واقعاً نسبت به ابزارهای CRISPR-Cas9 کمتر خطا دارند، تیم عملکرد آنها را در ویرایش DNA مقایسه کرد. آنها ژن β2-میکروگلوبولین را هدف قرار دادند زیرا این ژن پروتئین سطح سلولی را رمزگذاری می کند که به راحتی قابل تشخیص و تعیین کمیت با آنتی بادی ها است. آنها با استفاده از هر دو فناوری، ژن را در سلول های بنیادی خونساز (HSCs) تغییر دادند که هدف مشترک ژن درمانی برای بیماری های خونی.⁶ هر دو ابزار با کارایی نسبتاً بالایی ژن را حذف می کنند (تقریباً 80 تا 90 درصد)، اما ویرایشگرهای پایه جهش های ناخواسته بسیار کمتری نسبت به ابزار CRISPR-Cas9 تولید می کنند. همانطور که نالدینی مشکوک بود، تیم جهش‌های ناشی از شکستگی‌های دو رشته‌ای را در سلول‌های ویرایش‌شده پایه، البته در سطح پایین‌تری نسبت به سلول‌های ویرایش‌شده با CRISPR-Cas9، یافتند. این جهش ها در محل برش رخ داده است، که نشان می دهد که در طول تکرار به یک شکست تصادفی دو رشته ای تبدیل شده است. نالدینی گفت: این اشتباه است که بگوییم این فناوری بدون مشکل است.

این تیم همچنین بررسی کردند که آیا سیستم‌های ویرایش باعث واکنش‌های نامطلوب سلولی می‌شوند یا خیر. به نظر می رسد ابزار CRISPR-Cas9 یک مسیر ترمیم DNA را فعال می کند که توسط p53 هدایت می شود، پروتئینی به نام “نگهبان ژنوم“⁷ این برای ابزار ویرایشی که عمداً شکست های دو رشته ای ایجاد می کند، انتظار می رفت. با این حال، آنها همچنین فعال شدن p53 را در سطح کاهش یافته برای ویرایشگر پایه خاصی که سیتوزین را به تیمین تبدیل می کند، پیدا کردند.

CRISPR-Cas9 از یک نظر از ویرایشگرهای پایه بهتر عمل می کند: مصونیت ذاتی را ایجاد نمی کند. ویرایشگرهای اصلی از RNA های راهنمای طولانی استفاده می کنند که توسط سلول به عنوان محرک خارجی دیده می شود واکنش های ایمنی.⁸

این پاسخ ها نگران کننده هستند زیرا بازده HSC ویرایش شده تولید شده برای ژن درمانی هرگز 100 درصد نیست. با گذشت زمان، سلول‌های ویرایش‌شده ممکن است بمیرند، اگر تعدادشان بیشتر از موارد ویرایش‌نشده باشد، تحت فشار پاسخ‌های استرسی قرار نگیرند و دوام درمان را کاهش دهند. نشان می دهد: “این احتمالاً یک انتخاب منفی از آن سلول هایی است که شاید بیشترین بار واکنش ها و پیامدهای نامطلوب را داشته اند.” ساموئل فراریبیوتکنولوژیست و یکی از نویسندگان این مطالعه.

او گفت: «احتمالاً پیام اصلی ایمنی فناوری جدید است آناریتا میچو، یک زیست شناس مولکولی در موسسه Imagine که در این کار دخالتی نداشت. همکارش مگان بروسونکه او نیز در این مطالعه شرکت نداشت، افزود: “درست است که خطرات ژنوتوکسیک کمتری با ویراستاران پایه و ویراستاران اصلی وجود دارد، اما همانطور که این مقاله نشان می دهد، هنوز نگرانی هایی وجود دارد که باید در هنگام توسعه ژن درمانی یا ژنوم به آن توجه کنیم. استراتژی های ویرایش برای رویکردهای درمانی

خوشبختانه، محققان با بهینه سازی RNA های راهنما و سپس کاهش دوز مورد استفاده، راهی برای کاهش بیشتر اثرات ژنوتوکسیک ویرایشگرهای پایه به سطح غیرقابل شناسایی پیدا کرده اند. برای افزایش عمر RNA، ویژگی هایی مانند a کلاهک 5 سر که از تخریب آنها در سلول جلوگیری می کند.⁹ با این حال، بهینه سازی تمام اثرات ناخواسته را به طور کامل حذف نکرد. ویرایشگرهای پایه هنوز جهش‌هایی را در مکان‌های تصادفی در ژنوم خارج از سایت هدف ایجاد می‌کنند.

در نهایت، تیم ویرایش اولیه، تکنیک دیگر برش را بررسی کرد. به جای اصلاح یک جفت باز، چندین پایه را از یک رشته ژن حذف می کند و پایه های جدید را به جای آنها وارد می کند.² فراری گفت: «این جدیدترین کودک در میان تمام ابزارهای ویرایش است.

همچنین ببینید “ویرایش اولیه به سن می رسد“

مانند ویرایش پایه، ویرایش پایه منجر به جهش در محل نیک شد، که به معنای شکل گیری تصادفی شکستگی های دو رشته ای بود و باعث ترمیم DNA p53 به همراه مسیر سیگنالینگ ایمنی شد. مانند ویرایش اولیه، ابزار باید برای جلوگیری از این واکنش‌های سلولی ناخواسته بهینه شود.

ویرایش اولیه و اولیه نیز اثرات ناخواسته ای ایجاد می کند که تنها با بررسی دقیق قابل مشاهده است. فراری خاطرنشان کرد: به عنوان یک زمینه، ما اطلاعات زیادی در مورد داده های کارآزمایی بالینی، به عنوان مثال، حذف های طولانی مدت نداریم.

بروسون گفت: “در آینده، ما به فناوری قدرتمندتری برای توصیف بهتر اثرات ژنوتوکسیک فناوری ویرایش هسته و هسته نیاز داریم.”

میچیو و تیمش تحقیق می کنند ویرایش اپی ژنوم به عنوان یک ابزار جایگزین برای تعدیل ژن در درمان.¹⁰ این ابزارها با اصلاح ساختار کروماتین ژن ها را فعال یا سرکوب می کنند و جهش را وارد ژنوم نمی کنند. او گفت: «از نظر تئوری این بهترین و ایمن‌ترین استراتژی است که قطعاً از تمام این اثرات ژنوتوکسیک جلوگیری می‌کند، زیرا هیچ آنزیمی برای اصلاح DNA وجود ندارد.»

تنظیم کننده های بریتانیا اخیراً CRISPR-Cas9 را برای درمان بیماری سلول داسی شکل و بتا تالاسمی تأیید کرده اند و محققان قبلاً از سلول های ویرایش شده پایه استفاده کرده اند. برای درمان سرطان خون در یک دختر 13 ساله در بریتانیا.¹¹ اگرچه این ابزارهای ویرایش پتانسیل نجات جان افراد را دارند، این مطالعه نشان می دهد که ممکن است ارزش بررسی بیشتر خطرات ژنوتوکسیک آنها را داشته باشد.